初級(jí)概念
特定分子種類之間的相互作用的活細(xì)胞中的精確位置和性質(zhì)是在生物學(xué)研究的許多領(lǐng)域主要關(guān)心的，但是調(diào)查經(jīng)常被用來研究這些現(xiàn)象的文書的分辨率有限的阻礙。 常規(guī)寬視場熒光顯微鏡使在由瑞利判據(jù)，約200納米（0.2微米）所定義的光空間分辨率極限本地化熒光標(biāo)記的分子。 然而，為了理解所涉及的典型的生物分子的過程蛋白伙伴之間的物理相互作用，分子的相對(duì)接近度，必須更精確地確定比衍射限制的傳統(tǒng)的光學(xué)成像方法許可證。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移的技術(shù)中，當(dāng)施加到光學(xué)顯微鏡（更常用的縮寫為FRET簡稱），允許確定幾個(gè)納米內(nèi)的兩個(gè)分子之間的做法（見圖1），一個(gè)距離充分接近用于分子間的相互作用，以發(fā)生。


典型的熒光顯微鏡技術(shù)依賴于吸收由光的熒光團(tuán)在一個(gè)波長（激發(fā)），其次是次級(jí)熒光的波長更長的后續(xù)發(fā)射。 激發(fā)和發(fā)射波長通常彼此分離，以幾十到幾百納米。 細(xì)胞組分，如細(xì)胞核，線粒體，細(xì)胞骨架，高爾基體，和膜，以特定熒光團(tuán)的標(biāo)記使固定和活制劑內(nèi)的定位。 通過同時(shí)標(biāo)記幾個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與具有分開的激發(fā)和發(fā)射光譜個(gè)別熒光團(tuán)，專門熒光濾波器的組合可以被用來檢查標(biāo)記的分子在一個(gè)單一的細(xì)胞或組織切片的接近。 利用這種技術(shù)，分子更靠近在一起比光學(xué)分辨率極限看來是一致的，這明顯的空間接近性，表明一個(gè)分子締合是可能的。 在大多數(shù)情況下，但是，正常衍射限制熒光顯微鏡的分辨率是不夠的，以確定生物分子之間的相互作用是否實(shí)際發(fā)生。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移是由從激發(fā)態(tài)的熒光團(tuán)的能量的非輻射轉(zhuǎn)移發(fā)生在靠近的第二發(fā)色團(tuán)的方法。 因?yàn)樵谄渖系哪芰總鬟f可以發(fā)生限制在大約10納米（100埃），而轉(zhuǎn)移的效率的范圍是熒光團(tuán)之間的間隔距離極為敏感，共振能量轉(zhuǎn)移測量可用于探測分子相互作用的有價(jià)值的工具。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移的機(jī)制涉及的供體熒光團(tuán)在一個(gè)激發(fā)電子態(tài)，其可以在一個(gè)非輻射方式通過遠(yuǎn)程偶極-偶極相互作用的激發(fā)能量轉(zhuǎn)移到附近的受體發(fā)色團(tuán)。 理論支撐能量轉(zhuǎn)移是基于一種治療激發(fā)的熒光團(tuán)作為振蕩偶極子，可以經(jīng)受與具有相似的諧振頻率的第二偶極的能量交換的概念。 在這方面，共振能量轉(zhuǎn)移類似于耦合振子，例如一對(duì)音叉振動(dòng)在同一頻率的的行為。 與此相反，輻射能量轉(zhuǎn)移，需要發(fā)射的光子的和再吸收，并且依賴于物理尺寸和樣品的光學(xué)性質(zhì)，以及該容器的幾何形狀和波前通路。 不像輻射機(jī)理，共振能量轉(zhuǎn)移可產(chǎn)生顯著量有關(guān)的供體 - 受體對(duì)的結(jié)構(gòu)信息。

共振能量轉(zhuǎn)移不是熒光團(tuán)的周圍溶劑殼敏感，因此，會(huì)產(chǎn)生特有的，通過溶劑依賴性的事件，如熒光猝滅，激發(fā)態(tài)反應(yīng)，溶劑松弛，或各向異性測量表明分子信息。 于參與共振能量轉(zhuǎn)移熒光基團(tuán)的主要溶劑的影響是在供體和受體的光譜特性的影響。 發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移過更長的距離比短程溶劑效應(yīng)，以及成分的介電性質(zhì)（溶劑和宿主大分子）位于所涉及的熒光團(tuán)之間對(duì)共振能量轉(zhuǎn)移的功效，這主要取決于非常影響不大供體和受體熒光團(tuán)之間的距離。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象不是由光子發(fā)射介導(dǎo)，而且，甚至不要求受體發(fā)色團(tuán)是熒光的。 在大多數(shù)應(yīng)用中，然而，無論是供體和受體是熒光，和能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生本身表現(xiàn)通過供體熒光和減少的熒光壽命的淬火，也伴隨著增加受體的熒光發(fā)射。 能量轉(zhuǎn)移過程的效率成比例地分離供體和受體分子的距離的倒數(shù)第六功率變化。因此，F(xiàn)RET測量可以用作一個(gè)有效的分子尺 ，用于確定生物分子標(biāo)記與合適的供體和受體熒光染料時(shí)，他們中的10納米彼此之間的距離。

連接到相同的大分子蛋白質(zhì)的相對(duì)端的兩個(gè)熒光染料之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的一個(gè)假設(shè)的例子示于圖1中的天然構(gòu)象（圖1（a）），這兩個(gè)熒光團(tuán)是由約12納米的距離隔開，太多的熒光染料之間的分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移發(fā)生。 但是，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被誘導(dǎo)經(jīng)歷構(gòu)象變化（圖1（b）），這兩個(gè)熒光染料被帶到更接近在一起，現(xiàn)在可以參與的FRET的分子相互作用。 在該圖中，供體熒光的激勵(lì)是通過圍繞黃色三核的芳族分子藍(lán)色輝光表示，而相應(yīng)的受體發(fā)射（圖1（b））由圍繞在右側(cè)的第二雜環(huán)熒光綠色輝光表示蛋白質(zhì) - 手側(cè)。 能量轉(zhuǎn)移測量常常用來估計(jì)對(duì)大分子站點(diǎn)和對(duì)這些距離的構(gòu)象變化的影響之間的距離。 在這種類型的實(shí)驗(yàn)，能量轉(zhuǎn)移的程度被用于計(jì)算供體和受體之間的距離，并獲取有關(guān)大分子的結(jié)構(gòu)信息。（奧林巴斯顯微鏡）


雖然熒光共振能量轉(zhuǎn)移經(jīng)常被用于研究在蛋白質(zhì)和脂類分子內(nèi)和分子結(jié)構(gòu)和功能上的修改，在活細(xì)胞中的一個(gè)主要障礙實(shí)施FRET顯微技術(shù)一直缺乏合適的方法用于標(biāo)記特定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與合適的熒光團(tuán)。 水母綠色熒光蛋白（GFP）及其在多種細(xì)胞類型中表達(dá)的克隆已經(jīng)成為一個(gè)重要的關(guān)鍵顯影標(biāo)記兩者的基因表達(dá)和結(jié)構(gòu)蛋白定位在活細(xì)胞中。 該蛋白質(zhì)的幾個(gè)光譜不同的突變的變體已經(jīng)被開發(fā)，包括發(fā)射藍(lán)光（ 藍(lán)色熒光蛋白，BFP）的熒光蛋白質(zhì)。 既激發(fā)和用于母體GFP發(fā)射光譜和BFP的突變體充分分開在波長為與FRET方法兼容。 圖2示出的策略檢測使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移和突變熒光蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用。 如果兩種蛋白質(zhì)，一種標(biāo)記用BFP（供體）和其它用GFP（受體），物理交互，然后在受體發(fā)射最大值（510納米）時(shí)，配合物是激發(fā)在最大吸收波長將觀察到強(qiáng)度增加（380納米）的供體。 蛋白質(zhì)的未形成復(fù)合物的結(jié)果中沒有受體（GFP）的熒光發(fā)射。

加上在脈沖激光器，顯微鏡光學(xué)，和基于計(jì)算機(jī)的成像技術(shù)的進(jìn)步，貼標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展，其中，供體和受體熒光團(tuán)實(shí)際上本身已啟用了動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)相互作用的可視化的活細(xì)胞內(nèi)的生物分子的一部分。 除了蛋白質(zhì)配偶體相互作用的調(diào)查，最近熒光共振能量轉(zhuǎn)移的應(yīng)用包括蛋白酶活性的研究中，在膜電壓電位，鈣代謝的改變，以及高通量篩選測定法的傳導(dǎo)，例如用于基因表達(dá)的定量單個(gè)活細(xì)胞。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理

共振能量轉(zhuǎn)移（RET）的過程可以發(fā)生在處于電子激發(fā)態(tài)的供體熒光團(tuán)轉(zhuǎn)讓其激發(fā)能量向附近的一個(gè)發(fā)色團(tuán)，該受體。 原則上，如果供體分子的熒光發(fā)射光譜重疊的受體分子的吸收光譜，和兩者的最小空間半徑內(nèi)，供體可以直接其激發(fā)能量通過長范圍偶極 - 偶極分子間轉(zhuǎn)移至受體耦合。 在20世紀(jì)40年代末提出的西奧多·福斯特一個(gè)理論最初描述參與共振能量轉(zhuǎn)移的分子間的相互作用，而福斯特也制定了正式的方程式定義的傳輸速率，發(fā)色團(tuán)距離，所涉及的發(fā)色團(tuán)的光譜特性之間的關(guān)系。

共振能量轉(zhuǎn)移是一個(gè)非輻射的量子力學(xué)的過程，不需要碰撞，并且不涉及生產(chǎn)熱。 當(dāng)能量轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)，受體分子猝滅供體分子熒光，并且如果受體本身是熒光染料，增加或敏化熒光發(fā)射被觀察（參照?qǐng)D3）。 這種現(xiàn)象可以通過激勵(lì)包含供體和受體分子的光對(duì)應(yīng)于最大吸收供體熒光團(tuán)的波長的試樣進(jìn)行觀察，并在波長為中心的附近的發(fā)射最大值的受體的檢測發(fā)出的光。 另一種檢測方法，在普及迅速增長，是測量受體的存在和不存在供體熒光團(tuán)的熒光壽命。


示于圖3是雅布隆斯基示出的供體發(fā)射和受體吸光度在熒光共振能量轉(zhuǎn)移之間所涉及的耦合轉(zhuǎn)換。 吸收和發(fā)射的轉(zhuǎn)換是由直的垂直箭頭（綠色和紅色，分別）表示，而振動(dòng)弛豫由黃色波浪箭頭指示。 耦合過渡繪制與建議其正確位置在圖雅布隆斯基他們應(yīng)該已經(jīng)出現(xiàn)，從光子介導(dǎo)的電子躍遷虛線。 在合適的接受體的存在下，供體熒光團(tuán)能夠在不發(fā)射的光子（圖3中由一個(gè)藍(lán)色箭頭示出）直接傳遞激發(fā)態(tài)能量給受體。 所得敏熒光發(fā)射具有與所述受體的發(fā)射光譜特性。

幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)必須被滿足，以便共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生。 除了供體和受體分子的重疊的發(fā)射和吸收光譜，兩個(gè)所涉及的熒光團(tuán)必須定位的范圍內(nèi)互相為1?10納米范圍內(nèi)。 如由福斯特來自方程描述（和下面討論），供體和受體分子之間的能量轉(zhuǎn)移效率隨著分離兩個(gè)距離的第六功率。 因此，供體熒光團(tuán)的由非輻射相互作用其激發(fā)能轉(zhuǎn)移到受體的能力與分子之間的距離的增加，限制了FRET現(xiàn)象到大約10納米的最大供體 - 受體分離半徑急劇減小。 在距離小于1納米，能量和/或電子轉(zhuǎn)移的幾個(gè)其它模式是可能的。 共振能量轉(zhuǎn)移過程的距離的依賴性是為其在分子間的相互作用的調(diào)查工具的主要基礎(chǔ)。 在活涉及分子標(biāo)記與供體和受體熒光團(tuán)細(xì)胞的研究中，共振能量轉(zhuǎn)移會(huì)發(fā)生僅分子足夠接近彼此生物相互作用之間。

用于共振能量轉(zhuǎn)移的附加要求是，供體分子的熒光壽命必須具有足夠的持續(xù)時(shí)間，以允許所述事件的發(fā)生。兩個(gè)速率（K（T））和能量傳遞的效率（E（T））直接相關(guān)的受體的存在和不存在下的供體熒光團(tuán)的壽命。根據(jù)福斯特的理論，和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，能量轉(zhuǎn)移的速率由下式給出：

KT = (1/τD) ? [R0/r]6
其中R（0）是福斯特臨界距離，τ（D）是在不存在受體的供體壽命，r是分離的供體和受體生色團(tuán)之間的距離。 的福斯特臨界距離（R（0））被定義為受體-供體分離半徑的量，傳送速率等于施主衰變（去激勵(lì)）在沒有受體的速率。 換句話說，當(dāng)供體和受體半徑（r）等于福斯特距離，然后轉(zhuǎn)移效率為50％左右。 在這種分離半徑，一半的施主激發(fā)能量被轉(zhuǎn)移到通過共振能量轉(zhuǎn)移的受體，而另一半是通過所有其他可用的方法，包括熒光發(fā)射的組合消散。

從概念上講，福斯特臨界距離是供體和受體分子在其下仍然會(huì)發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移之間的最大間隔長度。 臨界距離值通常落入范圍為2至6納米，這是偶然許多蛋白質(zhì)分子尺寸的數(shù)量級(jí)之內(nèi)。 此外，該臨界距離范圍也對(duì)應(yīng)于幾個(gè)其它生物顯著尺寸，如細(xì)胞膜的厚度和分離上具有多個(gè)亞基蛋白位點(diǎn)的距離。 R的值（0）（以納米）可從以下表達(dá)式計(jì)算：

R0 = 2.11 × 10-2 ? [κ2 ? J(λ) ? η-4 ? QD]1/6
其中κ-squared是描述供體和受體的過渡偶極子之間在空間中的相對(duì)方位的一個(gè)因素，J（λ）為重疊積分中的供體發(fā)射和受體的吸收光譜的區(qū)域（與波長用納米表示），η表示介質(zhì)的折射率，且Q（D）是供體的量子產(chǎn)率。

能量轉(zhuǎn)移，E（T）的效率，是光子通過被轉(zhuǎn)移到受主的施主吸收的分?jǐn)?shù)的量度，并且是相關(guān)的供體-受體的分離距離 r，通過公式：

r = R0 ? [(1/ET) - 1]1/6
和E（T）被評(píng)價(jià)為：

ET = 1 - (τDA/τD)
其中τ（DA）是在受體和τ（D）的存在下，供體壽命是在不存在受體的供體壽命。 因此，通過測定在受體的存在和不存在施主熒光壽命（其表示施主淬火的程度，由于受主），有可能確定分離供體和受體分子的距離。 在許多常用的技術(shù)中，能量傳遞效率是由受體的存在和不存在下的相對(duì)平均施主熒光強(qiáng)度的穩(wěn)態(tài)測量確定（不通過測定生存期）。

總之，能量轉(zhuǎn)移的速率取決于供體發(fā)射和受體的吸收光譜之間的光譜重疊的程度（參見圖4），供體的量子產(chǎn)率，供體和受體躍遷偶極矩的相對(duì)取向，并距離分離的供體和受體分子。 任何事件或過程，影響供體和受體之間的距離將影響共振能量轉(zhuǎn)移速率，因此使得現(xiàn)象進(jìn)行量化，只要工件可被控制或消除。


呈現(xiàn)在圖4中為青色熒光蛋白（CFP，供體）和紅色熒光蛋白（RFP或紅色熒光蛋白 ，受體）時(shí)比較它們的潛在應(yīng)用為熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)的吸收和發(fā)射光譜。 這兩個(gè)生物肽吸收光譜被示出為紅色的曲線，而發(fā)射光譜表示為藍(lán)色曲線。 供體發(fā)射和受體的吸收光譜之間的重疊區(qū)域是由曲線的底部附近的灰色區(qū)域表示。 每當(dāng)分子的光譜重疊增加太遠(yuǎn)，從激發(fā)受體哪些信號(hào)（產(chǎn)生于供體的激發(fā)光照）和供體發(fā)射在受體發(fā)射信道檢測這種現(xiàn)象稱為頻譜出血或交叉出現(xiàn)。 其結(jié)果是，必須從弱受體熒光發(fā)射被提取高背景信號(hào)。

非輻射能量傳遞的基本理論是直接適用于一個(gè)供體-受體對(duì)由固定距離分開，在這種情況下，能量轉(zhuǎn)移的速率是福斯特距離的函數(shù)，R（0），而這又取決于κ-squared J（λ），η，和Q（D）中 。 如果這些因素是已知的，供體和受體之間的距離可以被計(jì)算出來。 更復(fù)雜的制劑是必需的來描述，如多受體生色團(tuán)和距離的分布的情況。 示于表1中的一系列實(shí)驗(yàn)測量福斯特臨界距離，這是從幾個(gè)流行供體 - 受體熒光團(tuán)對(duì)的光譜重疊確定。 因?yàn)樽兞堪ㄊ┲鱭uantium收率和光譜重疊的程度，這兩者都取決于局部環(huán)境條件，福斯特距離值應(yīng)相同的實(shí)驗(yàn)條件下的那些來探討共振能量轉(zhuǎn)移下來確定。

能量傳遞介質(zhì)的折射率，通常從溶劑組合物已知的，或可估計(jì)為一個(gè)特定的大分子，并且通常取為在水溶液中1.4。 供體的量子產(chǎn)率是通過比較與已知的量子產(chǎn)率標(biāo)準(zhǔn)確定的熒光。 由于Q（D）出現(xiàn)第六根R的計(jì)算（0），在Q（D）的值小錯(cuò)誤或不確定性不會(huì)對(duì)福斯特距離計(jì)算有很大的影響。 還由于第六根依賴性，R（0）未很大程度上受以J的變化（λ），但重疊積分仍然必須為每個(gè)供體-受體對(duì)評(píng)價(jià)。 在一般情況下，更高程度的供體發(fā)射光譜和受體的吸收光譜之間的重疊產(chǎn)生較大福斯特臨界距離值。

對(duì)于福斯特臨界距離 
常見的RET供體-受體對(duì)
Donor Acceptor F?rster Distance
(Nanometers)
Tryptophan Dansyl 2.1
IAEDANS (1) DDPM (2) 2.5 - 2.9
BFP DsRFP 3.1 - 3.3
Dansyl FITC 3.3 - 4.1
Dansyl Octadecylrhodamine 4.3
CFP GFP 4.7 - 4.9
CF (3) Texas Red 5.1
Fluorescein Tetramethylrhodamine 4.9 - 5.5
Cy3 Cy5 >5.0
GFP YFP 5.5 - 5.7
BODIPY FL (4) BODIPY FL (4) 5.7
Rhodamine 6G Malachite Green 6.1
FITC Eosin Thiosemicarbazide 6.1 - 6.4
B-Phycoerythrin Cy5 7.2
Cy5 Cy5.5 >8.0
表1
（1）5-（2- iodoacetylaminoethyl）氨基萘-1-磺酸 
（2）N-（4-二甲基氨基- 3,5-二硝基苯基）馬來酰亞胺 
（3）羧基琥珀酰亞胺酯 
（4）4,4-二氟-4-硼雜3α，4α二氮雜-s-苯并二茚
在評(píng)價(jià)取向系數(shù)的不確定性（κ-squared）已在文獻(xiàn)中廣泛討論，盡管實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，福斯特理論是有效的，并適用于距離測量，該變量繼續(xù)是有些爭議。 要認(rèn)識(shí)到福斯特距離為κ-squared，2/3（0.67）典型的動(dòng)態(tài)平均值的假定值通常給它是重要的。 這假定從供體和受體的方向隨機(jī)值結(jié)果進(jìn)行旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散之前，能量轉(zhuǎn)移。 取向因子取決于在供體發(fā)射偶極子和受體吸收偶極的空間相對(duì)取向，并且范圍可以從零到4的值1對(duì)應(yīng)于平行過渡偶極子，而4個(gè)結(jié)果值從偶極子都平行線的和。

因?yàn)榈诹P(guān)系到福斯特距離，在取向因子為1至4的變型只產(chǎn)生在所計(jì)算出的距離的26％的變化，和35％的最大誤差是可能的，當(dāng)為0.67的習(xí)慣假定值是應(yīng)用。 如果偶極恰好彼此垂直和相應(yīng)的κ-squared值取向的最嚴(yán)重的潛在的錯(cuò)誤結(jié)果變?yōu)榈扔诹恪?幾種技術(shù)處理的不確定性已經(jīng)采用，包括一系列的靜態(tài)取向存在和熒光團(tuán)的激發(fā)態(tài)壽命期間不改變的假設(shè)。 熒光各向異性的供體和受體的測量可以允許為κ-squared變化來確定極限。 此外，利用具有低熒光偏振（由于從幾個(gè)重疊躍遷發(fā)射）的熒光團(tuán)的減少在取向因子的不確定性。 κ-squared以這種方式的可能值的限制減少了潛在的距離計(jì)算誤差到大約10％左右。

在許多情況下，取向的因素是困難的，如果不是不可能的，以確定與該變量的精確值往往被視為一個(gè)難以克服的問題。 然而，一些證據(jù)表明該因子在共振能量轉(zhuǎn)移計(jì)算的重要性的限制。 利用共振能量轉(zhuǎn)移光譜和X射線衍射技術(shù)供體和受體的距離比較很大程度上支持假設(shè)的0.67的值的系數(shù)（所建議的福斯特理論），至少對(duì)于小肽和蛋白質(zhì)的有效性。 更多的不確定性存在較大的蛋白質(zhì)。 使用這種價(jià)值取向的因素是，這兩個(gè)供體和受體的探針可以自由地進(jìn)行無限制的各向同性運(yùn)動(dòng)的假設(shè)下有效。 進(jìn)一步的理由是從實(shí)驗(yàn)證據(jù)獲得，對(duì)于附接由一個(gè)單鍵或雙鍵與大分子的熒光團(tuán)，供體和受體的節(jié)段性運(yùn)動(dòng)傾向于導(dǎo)致動(dòng)態(tài)隨機(jī)取向。


為松散結(jié)合的熒光染料，圍繞單鍵自由旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)應(yīng)使用的平均取向值的，但分子通過多個(gè)連桿站點(diǎn)約束的自由運(yùn)動(dòng)可能不會(huì)發(fā)生。 另一方面，零和4κ極值-squared所需要的供體和受體，這種情況是不可能達(dá)到的完整熒光偏振。 統(tǒng)計(jì)計(jì)算已經(jīng)提出了一些調(diào)查人員認(rèn)為供體 - 受體分布距離和方向的確定所觀察到的平均距離。條件是在觀察到的距離的一些分布（這不是由供體和受體過于靠近相對(duì)于R（0）的限制），可以確實(shí)地得到熒光團(tuán)之間的平均距離和不確定性，由于評(píng)估取向系數(shù)。

取向因子對(duì)供體發(fā)射偶極和受體吸收偶極（圖5中示出）的相對(duì)取向的依賴性（κ-squared）是由下式給出：

κ2 = (cos θT - 3cos θDcos θA)2
= (sin θD sin θAcos Φ - 2cos θDcos θA)2
其中，θ（t）是供體的發(fā)射躍遷偶極和受體的吸收躍遷偶極，θ（D）和θ（A）之間的角度是這些偶極子和載體接合供體和受體之間的角度，并Φ是含有兩個(gè)過渡偶極子平面之間的角度。

能量傳遞效率是最敏感的距離變化時(shí)，供體-受體的分離長度接近福斯特距離（R（0））的兩個(gè)分子。 圖6示出了轉(zhuǎn)印效率和分離的供體和受體之間的距離的指數(shù)關(guān)系。 效率急劇增加到100％，因?yàn)榉蛛x距離減小到低于R（0），反之，減小到零，當(dāng)r大于R（0）。 由于距離上的轉(zhuǎn)移效率強(qiáng)（第六功率）的依賴，給體 - 受體分離距離測量是唯一可靠的當(dāng)供體和受體半徑的二分之一在于福斯特距離之內(nèi)。 當(dāng)r是約50％的R（0），共振能量轉(zhuǎn)移效率為接近最大和距離較短，不能可靠地確定。 當(dāng)供體-受體距離的50％超過了R（0）值，曲線的斜率是太淺，更長的間隔距離都沒有解決。


知道臨界福斯特距離的實(shí)際意義在于，值提供到可以由FRET對(duì)于給定的一對(duì)探針來確定分隔距離的范圍內(nèi)的導(dǎo)向器（見表1）。 因?yàn)槟芰哭D(zhuǎn)移測量到的距離的變化非常敏感，當(dāng)供體 - 受體距離是靠近福斯特距離，所述目標(biāo)分子相互作用的大致尺寸是在選擇的熒光染料對(duì)最重要的因素。 應(yīng)該考慮的，取決于是否穩(wěn)態(tài)或時(shí)間分辨測量也在進(jìn)行中的其他因素，包括化學(xué)穩(wěn)定性，量子產(chǎn)率，以及熒光團(tuán)衰變壽命。 因?yàn)闆]有內(nèi)部距離參考存在對(duì)于常見熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，走距離計(jì)算通過測量轉(zhuǎn)移效率是相對(duì)于福斯特距離，這是從在供體 - 受體對(duì)測量光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出。

由福斯特機(jī)制共振能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象是在其產(chǎn)生的效果在一些方面復(fù)雜的，但簡單和可靠。 福斯特距離是從供體和受體的光譜特性準(zhǔn)確預(yù)測的，并且由于沒有例外的理論尚未被確定，共振能量轉(zhuǎn)移可以假設(shè)將施主 - 受主分子對(duì)緊鄰任何條件下進(jìn)行。 在該理論描述偶極轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的復(fù)雜性轉(zhuǎn)移機(jī)制本身，不是因?yàn)?，但由于距離分布（包括非隨機(jī)分布），以及供體和受體分子的擴(kuò)散發(fā)生。 當(dāng)以平均距離在一定范圍內(nèi)的幾何形狀和時(shí)限的能量轉(zhuǎn)移的依賴正在采取措施，F(xiàn)RET是一種可靠的技術(shù)相互作用的分子間的空間分布研究。

FRET技術(shù)在光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用

顯微鏡構(gòu)參數(shù)為熒光共振能量轉(zhuǎn)移的調(diào)查與熒光團(tuán)，標(biāo)本和成像模式（多個(gè)）的要求而改變，但幾乎所有的直立或倒置顯微鏡可以改裝為FRET顯微鏡（見圖7）。 在一般情況下，在顯微鏡應(yīng)該裝有一個(gè)高分辨率（12位）中的冷卻和加強(qiáng)耦合到具有串?dāng)_對(duì)應(yīng)密切的熒光團(tuán)的光譜低水平（最小閉鎖電平）和帶通區(qū)域質(zhì)量干涉濾光器的CCD攝像系統(tǒng)。 探測器的靈敏度決定了帶通濾波器如何縮小可同時(shí)也使數(shù)據(jù)采集繼續(xù)以可接受的速度以最小的光譜出血通噪音。 在大多數(shù)情況下，一個(gè)單一的二色鏡耦合到激發(fā)和發(fā)射濾光輪或滑應(yīng)使用，以盡量減少或消除圖象偏移獲取圖像。

從熒光團(tuán)發(fā)射始發(fā)上方和下方的焦平面寬視場熒光顯微鏡患有與顯著外的聚焦信號(hào)，降低對(duì)比度，并導(dǎo)致圖像劣化產(chǎn)生的圖像。 因?yàn)楫a(chǎn)生作為能量共振轉(zhuǎn)移的結(jié)果，固有的低信號(hào)電平的這個(gè)問題更加復(fù)雜的FRET顯微鏡。 數(shù)字去卷積技術(shù)可耦合到光學(xué)切片，以減少或消除信號(hào)遠(yuǎn)離焦平面，但過程是計(jì)算密集型的，可能不足夠快許多動(dòng)態(tài)FRET成像實(shí)驗(yàn)。 激光掃描共聚焦技術(shù)可以應(yīng)用到FRET顯微鏡以產(chǎn)生橫向分辨率一個(gè)顯著改善，同時(shí)使串行光學(xué)切片的收集間隔接近實(shí)時(shí)。 共焦顯微鏡的主要缺點(diǎn)是激發(fā)波長到可用于特定系統(tǒng)，它限制了熒光團(tuán)供體和受體對(duì)在共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的選擇標(biāo)準(zhǔn)的激光線的限制。 多光子激發(fā)也可以采用結(jié)合FRET技術(shù)和較少損害由于所涉及的較長的激發(fā)波長的細(xì)胞。 另外，自體熒光的工件和試樣的光漂白的可能性較小多光子激發(fā)的限制激發(fā)體積特性內(nèi)發(fā)生。

能夠觀察活細(xì)胞中培養(yǎng)幾個(gè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像圖案的一個(gè)典型的顯微鏡結(jié)構(gòu)示于圖7中倒組織培養(yǎng)顯微鏡配備在柱子上的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的鹵鎢燈燈箱以檢查并記錄細(xì)胞使用標(biāo)準(zhǔn)的明場，相襯，或微分干涉對(duì)比（DIC）的照明。 需要注意的是后兩種對(duì)比增強(qiáng)技術(shù)可以組合使用與熒光以顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的熒光團(tuán)的空間位置。 一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的珀耳帖冷卻的CCD照相機(jī)系統(tǒng)附連到顯微鏡三目為寬視場熒光和明視場圖像捕獲。


共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)使用任一廣角照明（電弧放電燈）或?qū)崟r(shí)掃描共焦附件配備有高速尼普科夫盤系統(tǒng)在圖7所示的多光譜顯微鏡進(jìn)行。 氬氪激光束通過一個(gè)聲光可調(diào)諧波長設(shè)備第一濾波傳遞到共焦掃描頭之前，選擇特定的激發(fā)波長。 圖像采集采用兩個(gè)高分辨率第三代強(qiáng)化的冷卻CCD相機(jī)讀獨(dú)立通道，并纏繞到主機(jī)。 掃描樣品在橫向（x和y）和軸向（z）的平面能夠收集的光學(xué)切片的三維圖像重建。 多種圖像處理軟件程序的說明顯微鏡配置兼容。

基于這種現(xiàn)象的根本原則，一些重要的實(shí)際點(diǎn)時(shí)，應(yīng)考慮熒光共振能量轉(zhuǎn)移測量用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行：

供體和受體熒光團(tuán)的濃度必須精密控制。 當(dāng)許多受體分子的環(huán)繞單一供體分子發(fā)生實(shí)現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的統(tǒng)計(jì)學(xué)概率最高。
漂白必須消除，因?yàn)樵摴ぜ梢愿淖児w到受體分子的比例，并且因此，共振能量轉(zhuǎn)移過程的測量值。
供體的熒光發(fā)射光譜和受體的吸收光譜應(yīng)該具有相當(dāng)大的重疊區(qū)域。
應(yīng)該有用來激發(fā)捐助的波長區(qū)域的受體的最小直接激發(fā)。 在穩(wěn)定狀態(tài)下FRET顯微鏡測量誤差的一個(gè)常見原因是供體發(fā)射與受體過濾器集的檢測。
兩者的供體和受體的發(fā)射波長必須與檢測器的最大靈敏度范圍一致。
供體的吸收和發(fā)射光譜應(yīng)該具有最小的重疊，以降低供體到供體的自轉(zhuǎn)移的可能性。
供體分子必須是熒光和顯示，以便共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生足夠長的壽命。
供體應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出低的偏振各向異性的方向的值最小化的不確定性（κ-squared）因子。 這一要求被捐助者，其排放結(jié)果從層巒疊激發(fā)過渡滿意。
當(dāng)使用抗體標(biāo)記技術(shù)，試劑綴合有供體和受體熒光不應(yīng)改變其生物活性。 任何活性降低，會(huì)嚴(yán)重影響所得共振能量轉(zhuǎn)移測量的有效性。
因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移，需要供體和受體分子，以具有相應(yīng)的偶極對(duì)準(zhǔn)并定位在10納米彼此中，向其中相連接的分子，必須考慮所用試劑和三級(jí)結(jié)構(gòu)。 例如，當(dāng)供體 - 受體分子可以附著到蛋白質(zhì)上不同的結(jié)構(gòu)的位置（如羧基或氨基末端），它是可能的FRET不會(huì)被觀察到，即使蛋白質(zhì)不相互作用，因?yàn)槭┲骱褪苤鞣肿游挥谒鱿嗷プ饔梅肿拥膬啥恕?br /> 標(biāo)記有綠色熒光蛋白的突變體對(duì)FRET調(diào)查活細(xì)胞應(yīng)該用傳統(tǒng)免疫組織化學(xué)技術(shù)，以驗(yàn)證該標(biāo)記的蛋白質(zhì)，采用相同的細(xì)胞內(nèi)的棲息地和屬性與天然對(duì)應(yīng)物進(jìn)行分析。
為了使熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，以提供有意義的數(shù)據(jù)作為在光學(xué)顯微鏡的工具，既樣品制備和成像參數(shù)必須優(yōu)化。 適當(dāng)?shù)墓w和受體的探針在它們被用作分子標(biāo)記的選擇和方式是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。 另外，一旦一個(gè)標(biāo)記策略，其允許能量轉(zhuǎn)移已經(jīng)闡明，可以使用很寬的技術(shù)光譜進(jìn)行測量本身。 大多數(shù)的定量熒光顯微術(shù)調(diào)查是通過測定熒光發(fā)射的強(qiáng)度進(jìn)行的。 熒光強(qiáng)度為基礎(chǔ)的檢測FRET的通常通過監(jiān)測變化的發(fā)光強(qiáng)度的在對(duì)應(yīng)于供體和受體生色團(tuán)的兩種波長的相對(duì)量來實(shí)現(xiàn)的。 當(dāng)條件合適熒光共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)，增加受體發(fā)射（I（A））是伴隨著在供體發(fā)射（Ⅰ（D））的強(qiáng)度的伴隨減少。

雖然在任一施主或受主的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的變化可被視為指示共振能量轉(zhuǎn)移的，習(xí)慣的做法是利用兩個(gè)值，I（A）/ I（D）的比率，作為衡量FRET。 比的值取決于供體 - 受體對(duì)之間的平均距離，是不敏感的路徑長度和體積的激發(fā)光束訪問的差別。 任何誘導(dǎo)在分子對(duì)之間的相對(duì)距離的變化樣品條件生產(chǎn)中的供體和受體發(fā)射的比值的變化。 因此，F(xiàn)RET可以在顯微鏡由一個(gè)相互作用受體熒光團(tuán)的輻射增加的供體熒光團(tuán)和檢測的優(yōu)先激發(fā)，伴隨著供體熒光減少通過由于能量轉(zhuǎn)移猝滅產(chǎn)生觀察。 FRET的測量采用強(qiáng)度監(jiān)測方法被稱為穩(wěn)態(tài)熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像。


合適供體和受體探針的其吸收和發(fā)射光譜特性的基礎(chǔ)上選擇。 為了獲得最大的共振能量轉(zhuǎn)移，供體的發(fā)射光譜應(yīng)基本上重疊受體的吸收光譜。 此外，應(yīng)該有受體熒光的激發(fā)最大值的供體的最小直接激發(fā)，并且不應(yīng)該有在其受體發(fā)生發(fā)光的波長區(qū)域的供體和受體之間顯著發(fā)射重疊。 在實(shí)踐中，它可以是難以識(shí)別供體 - 受體對(duì)滿足這些要求。 這種情況通常是由以下事實(shí)的市售熒光濾波器集是不能完全有效地，只透過所希望的波長，并且光的一小部分的設(shè)計(jì)通帶外可發(fā)送復(fù)雜。 除非非常良好表征和控制的表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，供體和受體熒光團(tuán)的確切濃度可能難以確定。 也可以將所需的自體熒光，光漂白，并且背景熒光的附加校正。

在活細(xì)胞中培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)的典型調(diào)查與細(xì)胞凋亡，從順序相互作用的一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的一個(gè)physicological過程相關(guān)聯(lián)的事件表示在圖8。 直接參與的事件鏈的基因產(chǎn)物可以通過熔化，以通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移來探測特定的關(guān)聯(lián)被標(biāo)記到熒光蛋白家族的適當(dāng)部件（在此情況下，BFP和GFP），用于共表達(dá)在相同細(xì)胞。 參與凋亡的蛋白在線粒體內(nèi)進(jìn)行交互，并作為程序性細(xì)胞死亡進(jìn)行結(jié)合顯示逐漸下降。 因此，供體發(fā)射的圖像（圖8（a））包含來自BFP標(biāo)記蛋白僅熒光，而相應(yīng)的受體發(fā)射信息（圖9的（b））示出的信號(hào)是由于蛋白GFP標(biāo)記的（與從一定的貢獻(xiàn)供體發(fā)射）。 音柱濾波器（如圖8（c）），如下所述，揭示了熒光從兩種蛋白質(zhì)之間共振能量轉(zhuǎn)移衍生

之間可能潛在影響的一般熒光共振能量轉(zhuǎn)移測量的準(zhǔn)確度的因素，一些是高度特異性的光學(xué)顯微鏡。 在顯微鏡調(diào)查的一個(gè)主要目標(biāo)是獲得高清晰度的圖像，這需要特別注意的質(zhì)量和用來之間的供體和受體的吸收和發(fā)射波長光譜區(qū)別的濾光器的性能。 為了最大化信噪比（而不會(huì)有損試樣或處理被調(diào)查），有必要仔細(xì)權(quán)衡曝光的強(qiáng)度和時(shí)間與激發(fā)光的供體和受體熒光團(tuán)的濃度與檢測器效率。 如果供體 - 受體熒光團(tuán)的濃度過剩，自猝滅可以發(fā)生，影響FRET測量的精確度。 漂白是與所有熒光團(tuán)中的問題，并能影響供體 - 受體的比例，改變熒光測量。 過量照度也可以破壞標(biāo)本，特別是那些含有活細(xì)胞或組織中。

稱為施主光漂白熒光共振能量轉(zhuǎn)移（pbFRET），它利用了漂白過程以測量FRET的技術(shù)，通常是在固定化標(biāo)本的研究應(yīng)用。 基于逐像素分析，該方法已被應(yīng)用到測量標(biāo)記熒光團(tuán)綴合的單克隆抗體的細(xì)胞表面蛋白之間的鄰近關(guān)系。 漂白FRET是建立在理論熒光團(tuán)是光損傷，只有當(dāng)它被提升到激發(fā)態(tài)敏感。 在統(tǒng)計(jì)上，分子的只有一小部分是在任一時(shí)刻的激發(fā)態(tài)，因此，熒光團(tuán)具有較長熒光壽命有患光損傷的概率較高，并表現(xiàn)出較高的速率光漂白的。

支持這一概念的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，熒光團(tuán)的光漂白的時(shí)間與它的激發(fā)態(tài)壽命成反比。 共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生降低了供體分子的熒光壽命，有效地保護(hù)它針對(duì)光漂白。 pbFRET的計(jì)算是基于供體的下降速率漂白相對(duì)于測定在不存在共振能量轉(zhuǎn)移的供體。 漂白在FRET研究的測量需要一個(gè)相對(duì)長的時(shí)間內(nèi)，因而是最適用于固定細(xì)胞樣品，其中的時(shí)間數(shù)據(jù)是不重要的，從光漂白對(duì)細(xì)胞功能的影響是不是一個(gè)問題。 在某些方面，捐助漂白技術(shù)比致敏的排放測量不太復(fù)雜，但擬合的時(shí)間常數(shù)涉及多個(gè)組件漂白曲線提出了一些額外的困難。

能量傳遞效率也可以通過受體漂白技術(shù)，其中在供體發(fā)射猝滅的改變是通過前值和后選擇性地漂白的受體分子進(jìn)行比較，測定來確定。 在供體熒光強(qiáng)度的變化在同一檢體區(qū)域的分析，之前和除去受體后，有只需要一個(gè)單一的樣品制備的優(yōu)點(diǎn)，并直接關(guān)系到能量傳遞效率對(duì)供體和受體熒光。